BioArt按：2月21日，Genes & Devlopment杂志在线发表了来自浙大生命科学研究院（LSI）赵斌教授课题组题为“Single tumor-initiating cells evade immune clearance by recruiting type II macrophages”的最新论文。该项研究证明了YAP激活后促进肿瘤起始一方面是诱导肿瘤起始细胞（Tumor initiating cell，TIC），另一方面通过募集巨噬细胞聚集在TIC周围从而避免T细胞免疫监视清除肿瘤的功能。这个工作是对Hippo信号通路参与肿瘤免疫调控过程的全新认识，对于今后开发通过靶向作用于YAP影响肿瘤免疫调控的新方法在治疗肝癌的过程中具有潜在的指导意义。

尽管去年12月份UCSD管坤良课题组在Cell发表过相关研究，并且其结论在某些看来似乎和今天我们报道的文章有某种意义上的冲突，然而在不同的体系和模型下这种结果似乎不矛盾。为了让读者对这个工作能够深入的理解，BioArt特别邀请到了3位专家做了长篇精彩点评，在这些评论中，专家们不回避矛盾和冲突并且直接点明了文章可能存在一些不足以及今后需要继续研究的问题，我们相信这种点评模式将有助于形成良好的学术讨论氛围，让同行评价回归实处而真正有益于学术向前发展。

论文解读：

1995年两个课题组（其中一个为当时刚到耶鲁任教不久的许田课题组）分别独立在果蝇功能遗传筛选中报道了一个限制细胞数量和器官大小的基因Warts 【1,2】。2003年多个课题组使用类似的遗传筛选发现了另一个调控器官大小的基因Hippo位于Warts的下游，并命名了Hippo信号通路。2005年刚刚从德克萨斯西南医学中心move到约翰霍普金斯大学医学院的潘多加博士在Cell发表了一项重要的工作，首次在果蝇中发现Hippo信号通路中的关键转录辅激活因子Yki（哺乳动物中的同源蛋白是YAP）能被上游激酶Warts磷酸化并抑制其功能，初步阐明了Hippo信号通路从细胞质到细胞核的调节过程，进而通过调控下游基因的表达从而调控细胞的增殖和凋亡等【3】。Hippo通路在果蝇和哺乳动物中具有高度保守性，所以近十年来在遗传发育和肿瘤研究领域中广受关注，Hippo信号通路的关键调节机制详见下方示意图。

Hippo信号通路的基本调节过程，引自：Yu，F.X et al., （2015）,Cell

Hippo通路的蛋白激酶Mst1/2(Hippo)及Lats1/2(Warts)通过抑制YAP转录辅激活因子以及它的同源蛋白TAZ抑制细胞增殖和干细胞自我更新、促进细胞凋亡，从而控制细胞数量和器官大小。因此我们不难想象Hippo通路的蛋白激酶失活或YAP激活会促进肿瘤发生。的确如此，在许多小鼠模型中，例如肝脏特异性Mst1/2敲除或YAP转基因表达都迅速导致肿瘤发生，然而在促进肿瘤发生过程中的具体机制仍有许多问题需要进一步研究来阐明。

赵斌老师课题组的这项研究是继去年12月1日，加州大学圣地亚哥分校管坤良教授课题组在Cell发表Hippo通路参与肿瘤免疫重要文章（详见BioArt此前的报道：管坤良组Cell报道Hippo信号通路在肿瘤免疫调节中的重要作用——附同行专家点评）之后该领域的又一力作。在这项研究中，研究人员首先发现在YAP被激活后能够很好的募集巨噬细胞到肿瘤起始细胞周围。进一步研究表明，YAP激活通过转录激活趋化因子CCL2和集落刺激因子CSF1（ colony-stimulating factor-1）的表达导致肿瘤相关巨噬细胞（TICAM）聚集在TIC附近，从而避免T细胞免疫监视清除肿瘤起始细胞的功能。这一研究的亮点在于首次通过对肝脏肿瘤起始细胞的遗传操作证明了巨噬细胞的特异性招募在单个肿瘤起始细胞阶段对肝脏肿瘤发生的关键作用，并证明了Hippo通路是这一功能的关键分子机制。

在研究手段上，赵斌老师课题组采用了液态动力学注射PB 转座子介导的基因编辑系统在肝细胞内过表达YAP 或者敲除 LATS1/2进行原位成瘤实验，并通过同时RNA干扰敲减Hippo信号的下游关键因子发现了YAP在肿瘤发生过程中的新作用。值得一提的是，通过这一研究，赵斌课题组建立了一套灵活有效、可操作性强的研究体系，可以广泛用于在体内研究肝癌发生和肝细胞内信号转导的机制。

总的来讲，这个工作很好的展示了Hippo通路在肿瘤免疫调控中的重要作用。由于相关的工作处于起始阶段，相信赵斌老师课题组今后在上述研究的基础之上会有更多的发现。

参考文献：

1、Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., & Yu, W. (1995). Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development, 121(4), 1053-1063.

2、Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., & Bryant, P. J. (1995). The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & development, 9(5), 534-546.

3、Huang, J., Wu, S., Barrera, J., Matthews, K., & Pan, D. (2005). The Hippo signaling pathway coordinately regulates cell proliferation and apoptosis by inactivating Yorkie, the Drosophila Homolog of YAP. Cell, 122(3), 421-434

4、Yu, F. X., Zhao, B., & Guan, K. L. (2015). Hippo pathway in organ size control, tissue homeostasis, and cancer. Cell, 163(4), 811-828.

图为赵斌教授与本文第一作者郭晓灿（右）在实验室

专家点评：

王红艳（中科院上海生化细胞所研究员，2011年入选中科院“百人计划”，2014年获得国家“优青”资助）：

Hippo信号通路在各种系统中的研究越来越受重视。其中，国内科研院所的相关课题组也贡献不少优质的论文。赵斌老师本篇文章提出一个很有意思的论点，即YAP促进肝肿瘤起始细胞（Tumor initiating cell，TIC)直接分泌趋化因子CCL2，间接升高CSF1，进而导致肿瘤相关巨噬细胞（TICAM）聚齐在TIC附近，避免T细胞免疫监视清除肿瘤的功能。其中，在肝中敲除YAP上游的Lats或Mst后，TIC的数量增多并促进TICAM聚集。文章同时提供大量数据检测p53， KRAS，EGFR，AKT等在此过程中的调控作用。管坤良老师近期的Cell文章（详见BioArt此前的报道：BioArt深度丨管坤良组Cell报道Hippo信号通路在肿瘤免疫调节中的重要作用——附同行专家点评）指出肿瘤细胞缺失Lats后，分泌富含核酸的外泌体，激活TLR/Myd 88通路，增强I型干扰素产生，增强肿瘤免疫，最终抑制肿瘤生长。这两篇文章得到不同的结论，可能与他们使用不同方法构建肿瘤的活体实验体系有关。（推荐阅读：王红艳研究员课题组近期精彩工作《王红艳组发现调控Cdc42活化和T细胞迁移的新机制——附专家点评丨学术速递》）

Cain博士（美国某知名研究所博后，Hippo信号通路研究专家）

赵斌老师的这篇文章发现了Hippo signaling 的下游YAP在肿瘤发生过程中的新作用， YAP 转录激活了趋化因子CCL2 和CSF1的表达，肿瘤细胞通过分泌这些趋化因子招募2型肿瘤相关巨噬细胞，从而使肿瘤细胞逃脱免疫系统的攻击，进而形成肿瘤。无独有偶，去年年底管坤良老师在Cell 上的报道双敲除Hippo pathway 的上游激酶LATS1/2能够增强肿瘤细胞的免疫原性激活宿主的免疫系统从而抑制肿瘤细胞的生长。这2位在 Hippo signaling 研究领域领军者的工作看似矛盾，提示我们Hippo signaling 在肿瘤免疫中起着非常重要但又十分复杂的作用。

笔者个人的有几点想法，和大家分享一下：1. Hippo signaling 参与肿瘤肿瘤免疫可能有时间性，在肿瘤发生的不同阶段可能起的不同作用。管坤良老师文章中主要采用移植瘤模型，肿瘤细胞注射量大，成瘤所需的时间也比较短（20天左右）， 而赵斌老师的这篇文章采用PB 转座子介导的基因表达系统在小鼠肝细胞内过表达YAP 或者KO LATS1/2, 稳定表达的效率低于1%，成瘤时间相对也比较长（3个月以上）。有没有可能在肿瘤发生的起始阶段，YAP 通过招募2型肿瘤相关巨噬细胞保护肿瘤细胞免于被宿主免疫系统清除，而在肿瘤迅速增长期，YAP过度激活反而激发了宿主免疫系统来抑制肿瘤？可以在赵斌老师的这套PB 转座子介导一个inducible 的YAP过表达系统，看一下在不同时间段激活YAP是否有不同的肿瘤免疫效应。2. 肿瘤相关巨噬细胞有1型和2型之分，一般认为1型肿瘤相关巨噬细胞抑制杀伤肿瘤而2型肿瘤相关巨噬细胞促进保护肿瘤。显然这篇文章中YAP 激活招募的应该是2型肿瘤相关巨噬细胞，但是文章中染色基本上都是用的广谱的巨噬细胞Marker而没有用2型肿瘤相关巨噬细胞的特异性Marker，这可能需要在后续实验中进一步确认。

缪洪明（第三军医大学副教授、博导）

赵斌教授课题组给大家讲述了一个关于肝脏微环境与巨噬细胞相互作用进而促进肿瘤发生发展的story。这个story的核心观点是单个的肿瘤起始细胞可通过募集2型巨噬细胞（M2）进而发生免疫逃逸。在研究过程中，作者应用了大量的复杂的基因操作手段，证实了肝脏细胞中YAP信号通路可转录调控CCL2（首次提出YAP/TEAD1可直接结合CCL2的启动子区），进而募集高表达CCR2的巨噬细胞（CD45+CD11b+或CD45+F4/80+）。正是在这群巨噬细胞的辅助下，肝脏的肿瘤得以继续进展，即作者所说的逃避免疫监视。然而显而易见，所展示的论文在此处稍有一些缺憾，比如：（1）作者称这群募集的巨噬细胞为M2，然而并没有做很确切的鉴定；（2）作者的结论是这群细胞帮助肿瘤起始细胞发生免疫逃逸，然而缺乏免疫逃逸的具体鉴定指标（比如，考察肿瘤相关T细胞的质与量）。另外，本论文的肿瘤模型均为肝脏肿瘤的发生模型，同样机制是否适用于其他肿瘤模型呢，比如结肠癌或者黑色素瘤？在经皮下或者尾静脉的移植瘤进展模型上，该机制是否也存在，也是比较有意思的科学问题。总的来说，赵教授课题组讲述了一个非常有意思的Story，该课题组通过在活体上进行基因编辑而诱发肿瘤的技术，可谓炉火纯青，非常值得大家借鉴。

致谢：感谢王红艳研究员、缪洪明副教授和Cain博士在百忙之中撰写的精彩点评！

赵斌，浙江大学生命科学研究院教授，肿瘤信号转导研究专家，2012年入选国家“青年千人计划”，2014年获得“国家优秀青年基金”资助。2003年本科毕业于浙大生科院，2004-2009年在美国密西根大学生物化学系获得博士学位，2009-2011年为美国加州大学圣地亚哥分校癌症研究中心博士后，回国后任浙大生研院PI至今。赵斌老师曾以第一作者身份在包括Cell、Nat Cell Biol、Cancer Cell、Genes & Dev、Dev Cell、PNAS、Cancer Res、Curr Opin Cell Biol、J Cell Sci等杂志上发表研究论文或综述、评论文章十多篇， 在Hippo signaling 研究领域做出了许多开创性的贡献，回国独立作为PI后又相继以通讯作者身份在Genes & Dev、Cell Res（封面文章）、Circulation Research 、JBC等杂志上发表系列文章，研究主要聚焦肝癌新型动物模型的建立和肝癌发生发展的细胞分子机制。

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